Il luogo dove sorge la Catacomba di San Sebastiano era nell'antichità una profonda depressione, utilizzata come cava di pozzolana e chiamata ad catacumbas (o "presso le cavità"), un nome che è diventato sinonimo di cimitero sotterraneo.
Dal primo secolo, il sito è stato intensamente sfruttato e costruito: le gallerie sotterranee sono state riutilizzate per ottenere nicchie funerarie, mentre in superficie sono stati costruiti diversi colombari e almeno due complessi residenziali (la cosiddetta piccola villa e grande villa) dotati di notevoli decorazioni pittoriche murali.
Verso la metà del II secolo, il fondo della valle fu interrato per creare un campo, su un lato del quale furono costruiti in successione tre mausolei (da Clodio Ermete, dagli Innocentiores, dagli Ax).
Un ulteriore interramento dell'area è stato effettuato per fare spazio alla costruzione della triclia, un portico delimitato da un muro sul quale sono presenti numerosi graffiti con invocazioni rivolte ai SS. Pietro e Paolo, venerati insieme in questo luogo intorno al 250.
Sul sito, quindi, l'imperatore Costantino (306-337) fece costruire una basilica a forma di circo romano (chiamata "circiforme").
Nel frattempo, già nel terzo secolo, iniziò a svilupparsi sottoterra la catacomba che ospitava le tombe dei martiri Sebastiano ed Eutichio.
